Salute riproduttiva in giovani uomini provenienti da zone ad alto inquinamento da PFAS: analisi ad interim pianificata

Introduzione

La letteratura epidemiologica mostra un numero crescente di studi sulla relazione tra sostanze per- e polifluoroalchiliche (PFAS) e qualità del seme. Tuttavia, nonostante un discreto numero di studi pubblicati sull’argomento,^1-11 le agenzie internazionali considerano questa relazione ancora incerta.^12-15 Tra gli altri studi, è di particolare importanza uno studio danese su un campione di 864 giovani uomini della popolazione danese generale, che ha mostrato associazioni inverse coerenti tra esposizione a PFAS materni (primo trimestre di gravidanza) e qualità dello sperma.¹⁰ Studi simili necessitano di essere replicati in altre popolazioni al fine di rafforzare l’interpretazione causale delle associazioni osservate.
L’opportunità del presente studio è data dal fatto che una vasta area della regione Veneto è stata teatro di un grave ed esteso inquinamento da PFAS tramite acqua potabile per oltre 30 anni (1985-2017).^16-18 

Obiettivo

L’obiettivo dello studio è di valutare l’associazione tra qualità del seme in età giovane adulta ed esposizione a PFAS, con particolare attenzione a diversi aspetti della esposizione: la concentrazione sierica e seminale di acido perfluoroottanoico (PFOA) e perfluorosulfonico (PFOS), l’esposizione fetale, la durata di esposizione. Nell’analisi ad interim qui presentata su un campione di 507 giovani adulti (18-37 anni) sui 1.000 arruolati nello studio trasversale, si sono valutate le associazioni dei livelli sierici e seminali di PFOA e PFOS, la residenza della madre in gravidanza e la durata di residenza del soggetto nell’area contaminata e i parametri di qualità del seme, in particolare la conta degli spermatozoi e la presenza di alterazioni morfologiche o di motilità degli spermatozoi.
L’analisi ad interim è stata pianificata nel disegno dello studio che prevede il coinvolgimento della popolazione nella conduzione dello studio e nel supportare l’arruolamento dei soggetti. Infatti, lo studio prevedeva la partecipazione spontanea dei soggetti maschi giovani adulti e, per garantire una forte adesione, sono state adottate varie strategie di coinvolgimento della popolazione secondo le modalità della ricerca partecipata. Coerentemente con questa impostazione, è stata prevista una restituzione rapida dei primi risultati dello studio nella forma di questa analisi ad interim. L’arruolamento è avvenuto nel periodo 2022-2023.

Materiali e metodi

Si tratta di uno studio trasversale. Con il termine “analisi ad interim” si intende una valutazione preliminare su un sottoinsieme dei dati raccolti pianificata fin dall’inizio dello studio e volta a identificare i risultati più generali senza dover attendere il completamento di tutte le determinazioni analitiche sull’intero campione in studio. In questa analisi ad interim, sono stati utilizzati i dati su 507 giovani adulti (18-37 anni) residenti nei comuni della cosiddetta area rossa (province di Padova, Verona e Vicenza) arruolati tra il 2022 e il 2023. In particolare, le DGR 2133/2016 e 691/2018 della Regione Veneto hanno definito i comuni che sono stati riforniti con acqua potabile inquinata. Si è scelto di effettuare l’arruolamento solo nei comuni coinvolti per l’intero territorio comunale nel rifornimento idrico di acqua potabile inquinata, che per il presente studio sono: Albaredo d’Adige, Alonte, Arcole, Asigliano, Bevilacqua, Boschi S. Anna, Brendola, Cologna Veneta, Legnago, Lonigo, Minerbe, Montagnana, Noventa Vicentina, Orgiano, Pojana Maggiore, Pressana, Roveredo, Sarego, Terrazzo, Urbana, Veronella, Zimella.
Il protocollo di studio prevedeva:

• nascita nel periodo compreso tra il 1985 e il 2005 (periodo interessato dalla contaminazione delle acque potabili), corrispondente, quindi, a età anagrafiche comprese tra 18 e 37 anni al 2022-2023 (periodo di arruolamento);
• arruolamento spontaneo e volontario tramite iscrizione e prenotazione del giorno scelto per le visite su idonea piattaforma digitale;
• invio a ogni iscritto di un questionario digitale (oltre 100 domande) per esplorare la storia residenziale del soggetto e della madre durante la gravidanza e l’allattamento. La compilazione del questionario era un requisito indispensabile per poter partecipare alle fasi successive dello studio.

A seguito della compilazione del questionario, veniva fissato un appuntamento per eseguire i seguenti accertamenti:

• prelievo di sangue, per il dosaggio degli ormoni maschili (testosterone totale, FSH, LH), vitamina D, gli indici di sindrome metabolica (tecniche di studio: chemiluminescenza, apparecchiature: DXI 800 di Beckman Coulter);
• raccolta di un campione di sperma, con immediata lettura e produzione del referto relativo da parte di 2 biologi in forza al poliambulatorio SE.FA.MO. di Vicenza; l’esame è stato condotto secondo le indicazioni WHO 2021;¹⁹
• visita urologica con raccolta dell’anamnesi generale (fumo, alcol) e andrologica (presenza di varicocele e sua classificazione secondo Sarteschi, pregresse specifiche malattie uro-andrologiche) e alla visita (misurazione di peso, altezza, IMC, circonferenza addominale, valori pressori, esame obbiettivo dei genitali, insegnamento della tecnica di autopalpazione testicolare), effettuata da parte di un team di specializzandi della Scuola di Specializzazione di Urologia del Policlinico Universitario di Modena;
• ecografia testicolare, eseguita da 2 radiologi esperti (apparecchiature: ecografo Arietta 850 o Arietta SE (Hitachi), in modalità real time con utilizzo di sonde lineari ad alta risoluzione con frequenza compresa tra 7,5 e 14 MHz);
• densitometria ossea: misurazione della densità minerale ossea computerizzata (BMD) mediante assorbimetria a raggi X;
• quantitativi idonei di siero (55 ml) e di liquido seminale (in media 3,3 ml; min: 0,3 ml, max: 9,5 ml) sono stati divisi in aliquote e congelati a -80C°con successivo invio al Dipartimento di Scienze Biomediche e Sanità Pubblica dell’Università di Ancona per il dosaggio in entrambe le matrici di 17 composti PFAS, con LOD=0,1 e LOQ=0,5 ng/mL nel siero, e LOD=0,02 e LOQ=0,1 nel liquido seminale. È stato utilizzato un metodo analitico pubblicato in letteratura20 con alcune modifiche; questo metodo è stato nuovamente validato secondo le linee guida dell’Organization of Scientific Area Committees (OSAC) for Forensic Science.²¹ I composti dosati sono: PFBA, PFPeA, PFHpA, PFOA, PFNA, PFDA, PFUdA, PFDoA, PFBS, PFPeS, PFHxS, PFHpS, PFOS, PFEESA, PFMOPrA, PFMOBA, GenX (strumentazione: cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa tandem, Waters Acquity UPLC, Waters Corporation, Milan, Italy);
• alcune aliquote di siero e liquido seminale congelate a -80C° sono state inviate al Dipartimento di Scienze Chimiche dell’Università di Napoli Federico II e, per uno stoccaggio a lungo termine per usi futuri, al Dipartimento di Biologia. 
  Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico per le Sperimentazioni Cliniche della provincia di Vicenza il 08.11.2019 (prot. 113421) e, per alcune variazioni apportate, nuovamente approvato il 29.07.2021 (prot. 79483).

Metodi statistici

Sono stati considerati come esiti la conta di spermatozoi e la presenza di alterazioni di motilità (<42%) o morfologia (<4%) degli spermatozoi. La qualità del seme declina con l’età anagrafica, quindi è stata considerata come il confondente principale, controllato appaiando per anno compiuto. Altri confondenti sono stati controllati a posteriori mediante modelli di regressione multipla, rispettivamente, modelli lineari generalizzati (densità gamma, funzione di trasformazione logaritmica) a effetti misti per la conta di spermatozoi (come analisi di sensibilità modello binomiale negativo misto), modelli di regressione logistica condizionata per la presenza di alterazioni di morfologia o motilità. 

Controllo del confondimento per età

Come noto dalla letteratura, l’età anagrafica è una variabile in grado di influenzare la qualità seminale.^22-29 Purtroppo gli studi non coincidono tra loro per tipo di popolazioni studiate, per etnie, per fasce di età, per metodologia di studio degli spermatozoi, per la valutazione di altre covariate, oltre l’età, che sono in grado di influire sulla qualità seminale. Appare quindi non semplice acquisire dati confrontabili con quelli del presente studio. Tuttavia, vi è una certa concordanza in questi studi nel considerare la motilità e la morfologia come parametri seminali che sembrano risentire del fattore età più precocemente della conta totale degli spermatozoi, o del volume seminale, che cambiano comunque in maniera sensibile dopo i 38 anni. Quindi, sono state considerate strategie statistiche di controllo del confondimento, come spiegato di seguito.
Per quanto riguarda la conta degli spermatozoi, nel campione non appare una relazione con l’età dei soggetti arruolati, dato che sono tutti di età inferiore ai 38 anni, coerentemente con la letteratura andrologica. La figura 1 presenta il diagramma di dispersione tra conta spermatica ed età (è sovraimposta la curva lisciata, lowess). Diversamente, la presenza di alterazioni di motilità o morfologia risulta associata con l’età, anche nel range di età del presente campione (tabella 1) (score test per il trend: chi² 6,04; gdl 1; p=0,014).

L’effetto dell’età come confondente è teoricamente forte nei confronti della durata di residenza. L’associazione tra durata di residenza come proxy della durata di esposizione è al limite dell’identificabilità. Si è perciò scelto di controllare questo confondimento per mezzo dell’appaiamento, restringendo cioè i confronti entro anno di età (figura 2). A scopo illustrativo, si riporta anche il diagramma di dispersione con i punti colorati in rosso se riferiti a soggetti con alterazioni di motilità o morfologia degli spermatozoi (figura 3). I punti piccoli in verde sono riferiti a soggetti senza alterazioni e sono leggermente dislocati (jitter pari a 10) per permettere di apprezzare il loro numero. È evidente la maggior concentrazione di punti rossi lungo la bisettrice, ma è presente anche una certa variabilità della durata entro età.

Distorsione da selezione

Per quanto riguarda il controllo della distorsione da selezione, è stata seguita la strategia statistica di restrizione come spiegato di seguito. Il punto cruciale è che negli studi sulla qualità del seme è difficile escludere un’eventuale distorsione da selezione (soggetti più fragili o, nel caso di donatori, soggetti più fertili). Lo studio in oggetto si basa sull’arruolamento spontaneo e volontario. È stato quindi considerato con attenzione il caso dei soggetti con madre esposta in gravidanza (n. 437) rispetto ai soggetti con madre non esposta in gravidanza (n. 70), pensando che questo potrebbe influenzare la decisione di partecipare allo studio. La contaminazione delle acque fu scoperta nel 2014 e il contemporaneo piano di sorveglianza della Regione Veneto provocò una forte reazione e preoccupazione della popolazione, per cui si ritiene poco probabile un’autoselezione dei soggetti con madre residente alla gravidanza, diversamente da coloro con madre non residente in gravidanza e che sono immigrati nell’area negli anni successivi.
In tabella 2 si osserva che la percentuale di soggetti con alterazioni di motilità o morfologia è superiore per i soggetti con madre non residente al momento della gravidanza rispetto agli altri, mentre per i soggetti con madre residente all’epoca della gravidanza si trovano percentuali coerenti con le informazioni sull’entità della contaminazione.
Sono dunque sempre state condotte analisi ristrette a seconda della residenza della madre in gravidanza.

Risultati

Popolazione oggetto di studio

La popolazione studiata è da considerare come un campione della popolazione generale. L’analisi di tutte le caratteristiche demografiche rilevate mostra una prevalenza di fattori di rischio noti per produrre una cattiva qualità seminale simile a quella riscontrata in altri studi pubblicati in letteratura e relativi alla popolazione generale (tabella 3; nello specifico, consumo di alcol, fumo, IMC, circonferenza addominale, varicocele, pressione arteriosa). Anche le risposte fornite nel questionario suggeriscono che non si tratta di una popolazione selezionata per avere problemi di fertilità (ricerca di paternità con almeno un anno di rapporti non protetti).^21-24

Esposizione in studio: concentrazioni di PFAS nel siero e nel liquido seminale

In tabella 4 sono riportate le statistiche descrittive relative alle concentrazioni sieriche e del liquido seminale di PFOA e PFOS.
Si tratta di una popolazione che, al 2022-2023, risulta molto esposta, come del resto mostrato dal Piano di Sorveglianza della Regione Veneto, nonostante l’attivazione della filtrazione (estate 2013) e della doppia filtrazione (autunno 2017) introdotta per della rete acquedottistica dal momento della scoperta della contaminazione.

In questa analisi ad interim, ci si limita a considerare due esiti distinti: la conta degli spermatozoi e le alterazioni di motilità o morfologia. In tabella 5 sono riportate alcune statistiche relative agli altri indicatori di qualità del seme.

Esito in studio: conta degli spermatozoi

Come atteso, la distribuzione della conta degli spermatozoi è fortemente asimmetrica (figura 4).

L’analisi statistica è condotta specificando l’età come variabile di appaiamento e restringendo il campione ai soli soggetti con madre residente nell’area rossa in gravidanza (n. 426) e include le seguenti variabili nel predittore lineare:

• criptorchidismo (con trattamento chirurgico);
• ipospadia (con trattamento chirurgico);
• varicocele sinistro (classificazione di Sarteschi);
• PFOA e PFOS (concentrazione nel liquido seminale);
• età della madre alla gravidanza;
• allattamento;
• abitudine al fumo della madre;
• IMC (in classi);
• diabete (in classi);
• trigliceridi;
• frazione ad alta densità del colesterolo (HL);
• residenza a Lonigo della madre in gravidanza;
• durata di residenza nell’area rossa.

Come indicato nei metodi, si è specificato un modello lineare generalizzato misto con funzione di trasformazione logaritmica e densità Gamma. Come analisi di sensibilità, si è specificato anche un modello binomiale negativo misto.
In tabella 6 sono presentati i risultati dell’adattamento del modello. Trattandosi di un modello lineare generalizzato con funzione di densità Gamma e funzione di link logaritmica, i coefficienti di regressione sono stati espressi come variazioni (“var” nella tabella), cioè come rapporti di medie geometriche rispetto alla categoria di riferimento (nel caso di covariate categoriche) o per incrementi unitari (nel caso di covariate continue).

Criptorchidismo e varicocele sono associati a una diminuzione del numero di spermatozoi. I valori grezzi sono riportati nella tabella 7.
Non vi sono associazioni con le concentrazioni di PFOA o PFOS né con la durata di residenza nella zona contaminata. I coefficienti di correlazione di Spearman tra durata di residenza e concentrazioni attuali di PFAS sono deboli (log pfoa sierico: 0,25; log pfoa seminale: 0,18; log pfos sierico: 0,26; log pfos seminale: 0,05), come atteso, visto che l’esposizione legata la consumo di acqua potabile cessa in modo importante a partire dal 2013 e le misure di PFAS sono del 2022-2023.

Esito in studio: alterazioni della motilità o della morfologia degli spermatozoi

In tabella 8 sono presentate le statistiche descrittive relative alla percentuale di alterazioni della motilità e della morfologia. Nell’analisi, si è considerato un esito composito dicotomico dato dalla presenza di almeno una delle due alterazioni (101/505 20%, tabella 9).

Nella tabella 10, viene presentato il modello di analisi è una regressione logistica condizionata, con l’età come variabile di appaiamento. Le covariate sono le stesse considerate per la conta spermatica, a meno dell’ipospadia, per la quale, per motivi di mancata convergenza dell’algoritmo di adattamento del modello, sono stati esclusi i soggetti con risposta “non ricordo” (n. 19).
In questa analisi, la durata di residenza risulta associata alla presenza di alterazioni degli spermatozoi. Inoltre, si osserva un’associazione paradossale inversa con PFOS nel liquido seminale.

Discussione e conclusioni

È stata condotta questa prima analisi ad interim pianificata su circa il 50% del campione, come programmato. Ciò non permette di avere una grande potenza statistica, specialmente nel caso in cui ci si concentri sulla presenza di alcune alterazioni (per esempio, morfologia o motilità alterata sono presenti nel 20% dei soggetti analizzati). Le concentrazioni nel liquido seminale hanno una percentuale molto alta di valori inferiori a LOD/LOQ (specialmente per i PFOS) e, per questo, alcuni PFAS misurati al momento della valutazione andrologica/urologica mostrano alcune associazioni paradossali, che per i PFOS sono note e descritte in letteratura.^2,3,30
Per un campione ridotto di 168 soggetti, si disponde delle misure di PFOA sierico da parte del laboratorio (Università di Ancona) e da parte dell’ARPA Veneto nell’ambito del piano regionale di sorveglianza. La correlazione tra le due misure è molto alta (nella trasformata logaritmica, r 0,88; IC95% 0,84-0,91; differenza tra medie -0,067, p-value=0,06). Il nostro campione ha una media leggermente inferiore di quella del piano di sorveglianza, dato che i prelievi sono avvenuti in tempi leggermente successivi (tra il secondo round del piano di sorveglianza e le misure del presente studio sono intercorsi circa due anni). Le differenze sono comunque in accordo con i tempi di dimezzamento delle concentrazioni ematiche.
Per ora, è possibile confermare l’assenza di un’associazione tra concentrazioni sieriche e del liquido seminale di alcuni PFAS (PFOA, PFOS), misurata sui partecipanti il giorno dello studio, e la qualità degli indicatori seminali esaminati; risultato coerente con la letteratura più recente, anche relativa a studi con grande dimensione campionaria.⁹ I PFAS sono interferenti endocrini, quindi capaci di esercitare il massimo del danno qualora l’individuo venga esposto a questi contaminanti nelle età più fragili da un punto di vista endocrinologico, cioè nel periodo fetale-adolescenziale, più che in età adulta. Purtroppo, però, la quasi totalità degli studi finora pubblicati hanno valutato l’associazione cross-sectional con le concentrazioni sieriche di PFAS nei soggetti adulti nello stesso momento temporale delle determinazioni sulla qualità del seme. Questa carenza di evidenze empiriche spiega anche la prudenza delle agenzie internazionali sull’associazione tra PFAS e fertilità. 
Coerentemente con gli studi condotti in letteratura^6,10 sulle esposizioni fetali, in questa prima analisi ad interim, la durata di esposizione misurata come durata di residenza nell’area contaminata si mostra associata alla qualità del seme.
Questi primi riscontri, unitamente al fatto che la popolazione studiata si conferma ancora molto esposta, indicano di proseguire con la valutazione di tutti gli altri esiti sanitari previsti nello studio, in particolare sugli aspetti biomolecolari (modificazioni protammine/istoni) e su quale possa essere il significato della presenza di più contaminanti interferenti endocrini in rapporto alla presenza “storica” dei PFAS.

Conflitti di interesse dichiarati: nessuno.

Finanziamenti: il presente studio è stato reso possibile dal finanziamento dell’Associazione Medici per l’Ambiente ISDE Italia ODV.

Ringraziamenti: gli Autori desiderano ringraziare tutte/i le/gli appartenenti ai gruppi delle mamme NO PFAS (Lonigo, Legnago, Montagnana, Cologna), all’Associazione Legambiente Cologna, a ISDE Vicenza, in particolare il dottor Cordiano, a ISDE Italia, all’associazione CILLSA, per il grande impegno di supporto dato allo studio in tutte le sue fasi. Un ringraziamento particolare alle amministrazioni comunali, grazie alla cui collaborazione è stato possibile arruolare un numero così significativo di partecipanti. Grazie, inoltre, alla dottoressa Alice Biscuola, a Yuri Norghido e Michela Frigo del poliambulatorio SE.FA.MO. per l’attenta sorveglianza dedicata durante l’arruolamento, e alle dottoresse Roberta Sartori, Monica Pozza e a Renata de Cao per il prezioso aiuto fornito nelle fasi di stoccaggio e congelamento dei campioni di siero e liquido seminale.

Bibliografia

1. Joensen UN, Bossi R, Leffers H, Jensen AA, Skakkebæk NE, Jørgensen N. Do Perfluoroalkyl compounds impair human semen quality? Environ Health Perspect 2009;117(6):923-27. doi: 10.1289/ehp.0800517
2. Louis GMB, Chen Z, Schisterman EF et al. Perfluorochemicals and human semen quality: the LIFE study. Environ Health Perspect 2015;123(1):57-63. doi: 10.1289/ehp.1307621
3. Toft G, Jönsson BAG, Lindh CH et al. Exposure to perfluorinated compounds and human semen quality in arctic and European populations. Hum Reprod 2012;27(8):2532-40. doi: 10.1093/humrep/des185
4. Specht IO, Hougaard KS, Spanò M et al. Sperm DNA integrity in relation to exposure to environmental perfluoroalkyl substances - a study of spouses of pregnant women in three geographical regions. Reprod Toxicol 2012;33(4):577-83. doi: 10.1016/j.reprotox.2012.02.008
5. Joensen UN, Veyrand B, Antignac JP et al. PFOS (perfluorooctanesulfonate) in serum is negatively associated with testosterone levels, but not with semen quality, in healthy men. Hum Reprod 2013;28(3):599-608. doi: 10.1093/humrep/des425
6. Vested A, Ramlau-Hansen CH, Olsen SF et al. Associations of in utero exposure to perfluorinated alkyl acids with human semen quality and reproductive hormones in adult men. Environ Health Perspect 2013;121(4):453-58. doi: 10.1289/ehp.1205118
7. Di Nisio A, Sabovic I, Valente U et al. Endocrine disruption of androgenic activity by perfluoroalkyl substances:clinical and experimental evidence. J Clin Endocrinol Metab 2019;104(4):1259-71. doi: 10.1210/jc.2018-01855
8. Yitao Pan, Qianqian Cui, Jinghua Wang et al. Profiles of Emerging and Legacy Per-/Polyfluoroalkyl Substances in Matched Serum and Semen Samples: New Implications for Human Semen Quality. Environ Health Perspect 2019;127(12):127005. doi: 10.1289/EHP4431
9. Ugelvig Petersen K, Keglberg Hærvig K, Meulengracht Flachs E et al. Per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS) and male reproductive function in young adulthood; a cross-sectional study Environ Res 2022;212(Pt A):113157. doi: 10.1016/j.envres.2022.113157
10. Keglberg Hærvig K, Ugelvig Petersen K, Sørig Hougaard K et al. Maternal Exposure to Per- and Polyfluoroalkyl Substances (PFAS) and Male Reproductive Function in Young Adulthood: Combined Exposure to Seven PFAS. Environ Health Perspect 2022;130(10);107001. doi: 10.1289/EHP10285
11. C8 Science Panel. C8 Probable Link Reports. Disponibile all’indirizzo: http://www.c8sciencepanel.org/prob_link.html
12. EFSA Panel on Contaminants i the Food Chain (EFSA CONTAM Panel), Schrenk D, Bignami M et al. Risk to human health related to the presence of perfluoroalkyl substances in food. EFSA J 2020;18(9):e06223. doi: 10.2903/j.efsa.2020.6223
13. US Environmental Protection Agency. External peer review draft: Proposed approaches to the deri-vation of a draft maximum contaminant level goal for perfluorooctanoic acid (PFOA) (CASRN 335-67-1) in drinking water. 2021.
14. US Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Toxicological profile for Perfluoroalkyls. Atlant Department of Health and Human Services, Public Health Service, 2021. doi: 10.15620/cdc:59198
15. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. Guidance on PFAS Exposure, Testing, and Clinical Follow-Up. Washington (DC), The National Academies Press, 2022. doi: 10.17226/26156
16. Polesello S, Valsecchi S. Rischio associato alla presenza di sostanze perfluoro-alchiliche (PFAS) nelle acque potabili e nei corpi idrici recettori di aree industriali nella Provincia di Vicenza e aree limitrofe nell’ambito della Convenzione tra il MATTM e IRSA-CNR per la realizzazione di uno studio di valutazione del Rischio Ambientale e Sanitario associato alla contaminazione da sostanze perfluoro-alchiliche (PFAS) nel bacino del Po e nei principali bacini fluviali italiani. IRSA-CNR 2013. Disponibile all’indirizzo: https://sian.aulss9.veneto.it/index.cfm?action=mys.apridoc&iddoc=803
17. Sistema Epidemiologico Regionale. Ricognizione epidemiologica iniziale nell’area interessata dalla contaminazione idropotabile da PFAS. Padova 2016. Disponibile all’indirizzo: https://sian.aulss9.veneto.it/index.cfm?method=mys.apridoc&iddoc=817
18. Pitter G, Da Re F, Canova C et al. Serum Levels of Perfluoroalkyl Substances (PFAS) in Adolescents and Young Adults Exposed to Contaminated Drinking Water in the Veneto Region, Italy: A Cross-Sectional Study Based on a Health Surveillance Program. Environ Health Perspect 2020;128(2):27007. doi: 10.1289/EHP5337
19. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Sixth Edition. Geneva, WHO, 2021. Disponibile all’indirizzo: https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/343208/9789240030787-eng.pdf
20. Di Giorgi A, Basile G, Bertola F, Tavoletta F, Busardò FB, Tini A. A green analytical method for the simultaneous determination of 17 perfluoroalkyl substances (PFAS) in human serum and semen by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPCL-MS/MS). J Pharm Biomed Anal 2024;246:116203. doi: 10.1016/j.jpba.2024.116203
21. Di Giorgi A, La Maida N, Taoussi O et al. Analysis of perfluoroalkyl substances (PFAS) in conventional and unconventional matrices: Clinical outcomes. J Pharm Biomed Anal Open 2023;1:100002. doi: 10.1016/j.jpbao.2023.100002
22. Castellini C, Cordeschi G, Tienforti D, Barbonetti A. Relationship between male aging and semen quality: a retrospective study on over 2500 men. Arch Gynecol Obstet 2024;309(6):2843-52. doi: 10.1007/s00404-024-07448-8
23. Collodel CG, Ferretti F, Masini M, Gualtieri G, Moretti E. Influence of age on sperm characteristics evaluated by light and electron microscopies. Sci Rep 2021;11(1):4989. doi: 10.1038/s41598-021-84051-w
24. Veron GL, Tissera AD, Bello R et al. Impact of age, clinical conditions, and lifestyle on routine semen parameters and sperm kinematics. Fertil Steril 2018;110(1):68-75.e4. doi: 10.1016/ j.fertnstert.2018.03.016
25. Colasante A, Minasi MG, Scarselli F et al. The aging male: relationship between male age, sperm quality, and sperm damage, in a unselected population of 3124 men attending the fertility centre for the first time. Arch Ital Urol Androl 2019;90(4):254-59. doi: 10.4081/aiua.2018.4.254
26. Gunes S, Hekim GNT, Arslan MA, Asci R. Effects of aging on the male reproductive system. J Assist Reprod Genet 2016;33(4):441-54. doi: 10.1007/s10815-016-0663-y
27. Stone BA, Alex Am Werlin LB, Marrs RP. Age thresholds for changes in semen parameters in men. Fertil Steril 2013;100(4):952-58. doi: 10.1016/j.fertnstert.2013.05.046
28. Osadchuk L, Shantanova L, Troev I, Osadchuk A. Regional and ethnic differences in semen quality and reproductive hormones in Russia: A Siberian population-based cohort study of young men. Andrology 2021;9(5):1512-25. doi: 10.1111/andr.13024
29. Pino V, Sanz A, Valdés N, Crosby J, Mackenna A. The effects of aging on semen parameters and sperm DNA fragmentation. JBRA Assist Reprod 2020;24(1):82-86. doi: 10.5935/1518-0557.20190058
30. Luo K, Huang W, Zhang Q et al. Environmental exposure to legacy poly/perfluoroalkyl substances, emerging alternatives and isomers and semen quality in men: A mixture analysis. Sci Total Environ 2022;833:155158. doi: 10.1016/j.scitotenv.2022.155158