Interventi
22/12/2010

Interazioni geni-ambiente, studi genome-wide e epigenetica: le nuove sfide

,

Dopo le interazioni geniambiente è arrivata l’ondata degli studi di associazione genomewide. Sono state riposte grandi speranze nella possibilità di identificare un importante ruolo dei geni nelle malattie comuni tramite studi di associazione genomewide (GWA), e nuovamente la ricerca italiana ha contribuito alle ricerche in questo campo. Gli studi GWA permettono ai ricercatori di identificare pathways causali che non sono mai stati identificati precedentemente, questo apre nuove prospettive nella comprensione dei meccanismi di malattia, nella prevenzione e nella terapia. Il progetto HapMap fornisce le conoscenze necessarie per condurre studi GWA permettendo di identificare set di polimorfismi in singoli nucleotidi denominati tag che permettono di coprire l’intera variabilità a livello genomico, o la maggior parte di essa. La disponibilità di tecnologie poco costose per genotipizzazioni ad alta produttività, ha permesso la realizzazione di studi GWA per diverse patologie, inclusi diversi tipi di tumore, malattie cardiovascolari e neurologiche, diabete e condizioni di interesse farmacogenetico, oltre a endpoints non di malattia, come l’espressione genica e l’altezza. I GWA hanno identificato un gran numero di associazioni come mostrato in figura 1 – dal catalogo NHGRI degli studi GWA www.genome.gov/GWAStudies. La figura 1 è basata su uno studio condotto a metà del 2009. La maggior parte degli studi però ha portato ad associazioni deboli, con Odd Ratios (OR) nell’ordine di 1.15-1.30.

Un altro importante problema è la mancanza di informazioni sul significato funzionale delle associazioni. Inoltre per aumentare la trasparenza e selezionare i passi successivi che devono essere compiuti nella ricerca in un determinato campo, sono cruciali una continua e aggiornata integrazione di tutta l’evidenza, a partire da tutti gli studi, i vecchi studi, i GWA attuali e i futuri studi di replicazione, e una interpretazione attenta della robustezza dell’evidenza acquisita. La maggior parte degli studi GWA hanno evidenziato almeno una associazione con un alto livello di significatività statistica, ma quasi tutte le associazioni identificate sono deboli. Quando le replicazioni sono consistenti fra diversi gruppi di studio, l’evidenza statistica tende a essere molto forte. Molti dei risultati degli studi GWA sui tumori evidenziano nuovi loci, non identificati precedentemente. Alcuni dei risultati più robusti sui tumori hanno però OR nell’ordine di 1.062.23, di cui la maggior parte vicini al 1.2. In conclusione sembra che gli studi GWA possano portare all’identificazione di associazioni interessanti che potrebbero far luce sui meccanismi di malattia e forse sul coinvolgimento di fattori eziologici inaspettati, ma la maggior parte di questi studi e di queste associazioni sembrano essere disgiunti dalla ricerca delle cause ambientali delle patologie. Le linee di ricerca presentate precedentemente sono state dominate da gruppi di ricerca americani e inglesi, con un ruolo dei gruppi italiani principalmente relegato al disegno dello studio e raccolta di dati e campioni biologici. Ci sono state a ogni modo rimarchevoli eccezioni, come il progetto «Hypergenes», uno studio collaborativo sulla genetica dell’ipertensione sponsorizzato dall’Unione europea e coordinato da un gruppo italiano (http//www.hypergenes.eu/). Insieme all’esplosione degli studi GWA vi è stata un’altra ondata di ricerche originali in epigenetica in cui alcuni gruppi italiani hanno ricoperto il ruolo di capofila. Le caratteristiche di questa linea di ricerca sono differenti dalle precedenti. In questo caso infatti l’enfasi non è sulla tecnologia, come nel campo degli studi GWA, ma sulle esposizioni ambientali. L’eredità epigenetica che include la metilazione del DNA, la le modificazione modificazioni istonicaistoniche, e i microRNA, fornisce un meccanismo per la propagazione stabile di uno stato di attività genica da una generazione di cellule a quella successiva, in cui le esposizioni ambientali catturate dall’epigenoma possono essere perpetuate con effetti sulla salute duraturi.
La tabella 1 elenca alcuni studi italiani (con le referenze bibliografiche rilevanti). Le esposizioni a inquinanti ambientali come PM10 (particolato) e benzene sono state associate a cambiamenti nella metilazione di geni coinvolti nell’infiammazione e nella cancerogenesi. In uno studio sul PM10 i livelli di esposizione era negativamente associati con la metilazione in Alu (p=0,04) e le sequenze ripetute di LINE1 (p=0,04). La metilazione di iNOS era significativamente più bassa nei campioni di sangue post esposizione rispetto al baseline (p=0,02). Inoltre l’eposizione a benzene volatile era associata a una riduzione significativa della metilazione in LINE1 (2.33% per un aumento di 10 volte dei livelli di benzene; p=0,009) and Alu (1,00%; p=0,027). L’ipermetilazione in p15 (+0,35; p=0,018) e l’ipometilazione in MAGE1 (0,49%; p=0,049) erano associate a un aumento dei livelli di benzene. In un altro studio, Baccarelli e collaboratori hanno mostrato in un ampio campione che i patterns di metilazione possono seguire rapidamente i cambiamenti nell’esposizione alle particelle dell’inquinamento da traffico. La metilazione di LINE1 diminuisce a seguito di una recente esposizione a carbone nero, un indicatore di esposizione da traffico veicolare (beta=0,11; p=0,002) e PM2,5 (beta=0,13; p<0,001). Non è stata trovata nessuna associazionecon la metilazione di Alu (p>0,12).3 Nello stesso studio è stato dimostrato che individui con bassa metilazione in LINE1 hanno livelli plasmatici aumentati di VCAM1, un biomarker di rischio cardiovascolare, così come un’aumentata incidenza e mortalità per cardiopatie ischemiche e ictus. In altre professioni le esposizioni a piombo e a idrocarburi aromatici policiclici sono state associate ad alterazioni della metilazione del DNA. 4-10 Questi esempi mostrano l’importanza delle esposizioni negli studi di epigenetica. Tutti gli studi presentati in tabella 1 sono basati su DNA estratto da campioni di sangue. Poiché le modificazioni epigenetiche sono tessuto specifiche, le analisi epigenetiche basate sul DNA estratto da campioni di sangue non sono generalizzabili ad altri tessuti. Questa è un’importante differenza che intercorre fra gli studi genetici e gli studi epigenetici. Negli studi genetici, si assume che l’informazione genetica ricavata da ogni tessuto sia del tutto o quasi del tutto identica in tutti i tessuti dello stesso individuo. Inoltre nelle analisi genetiche si utilizza il sangue, o altri tipi di cellule facilmente ottenibili, come fonte di DNA, senza considerare il reale coinvolgimento di queste cellule nella patologia in studio.
Negli studi epigenetici invece, i ricercatori devono tenere in considerazione che, dato che le modificazioni epigenetiche sono tessuto specifiche, l’epigenoma dei leucociti del sangue è solo uno degli epigenomi che potrebbe essere potenzialmente coinvolti in una determinata patologia. In epigenetica quindi occorre valutare attentamente il ruolo del tipo di cellula usata come fonte di DNA nella patologia in studio. Sono inoltre necessari studi su tessuti diversi che potrebbero portare a una maggiore comprensione dei processi fisiopatologici di malattia.

L’integrazione della genomica e degli altri –omics

Infine, è importante menzionare che le nuove ricerche tendono a integrare diverse tecnologie omic. Un esempio di studio finanziato dalla Unione europea, dove diversi gruppi di ricerca italiani hanno un ruolo preminente, è Envirogenomarkers (www.envirogenomarkers.net e figura 2). Il progetto consiste nell’applicazione su larga scala delle tecnologie –omics in uno studio di popolazione con lo scopo di: a) scoprire e validare nuovi biomarker predittivi di un aumento di rischio di malattie croniche in cui l’ambiente può giocare un ruolo importante (tumore della mammella, linfoma NonHodgkin malattie dei bambini incluse allergie, malattie neurologiche e immunologiche, malattie tiroidee), b) studiare le associazioni fra questi biomarker ed esposizioni a inquinanti ambientali con proprietà carcinogeniche, immunotossiche o ormonali, che includono bifenili policlorinati (PBCs), idrocarburi aromatici policiclici (PAHs), cadmio, piombo, ftalati, ritardatori di fiamma bromati, inquinanti ambientali e prodotti di trattamento delle acque. c) scoprire e validare biomarker di esposizione dei sopraccitati inquinanti ambientali. Envirogenomarkers può essere considerato un esempio di studio di nuova generazione, in modo particolare grazie al fatto che queste nuove tecnologie ad alta produttività sono diventate mature per l’applicazione ad ampie coorti di popolazione. Lo studio envirogenomarkers è stato preceduto da una lunga serie di studi di validazione che avevano lo scopo di valutare la robustezza dell’utilizzo di tecnologie di laboratorio all’interno di studi di coorte. Inoltre, al contrario rispetto agli studi GWA, envirogenomarkers pone molta enfasi nella misurazione delle esposizioni ambientali.

 

Tabella 1. Studi di epigenetica con una componente ambientale condotti da ricercatori italiani
Table 1. Epigenetic studies with an environmental components conducted by Italian Investigators

 

Geneenvironment interactions, genomewide studies, epigenetics: the new challenges

Epidemiology has made an effort in the last two decades to integrate tools and concepts of genetics. For at least one decade the expectation was that geneenvironment interactions (GEI) could represent a fruitful field of research, particularly for cancer.The aim was to possibly identify highrisk subgroups in order to reinforce the biological plausibility of associations and increase statistical power. However, few real examples of GEI have emerged: to mention just a couple, to which Italian research has contributed, NAT2 and bladder cancer, 1 and ALDH2 and upper aerodigestive cancer. 2 After GEI, the wave of genomewide association studies came. There were considerable expectations about the ability of genomewide association (GWA) studies to make exciting discoveries about the role of genes in common diseases, and, again, Italian research has substantially contributed. GWA studies may allow researchers to identify causal pathways that have not been unveiled before, thus opening new avenues to disease understanding, prevention and therapy.The HapMap project has provided the necessary background for the conduct of GWA studies by allowing identification of sets of tagging singlenucleotide polymorphisms that cover the entire variability at the genomic level, or most of it. The availability of inexpensive technologies for highthroughput genotyping has allowed performing GWA scans for several diseases, including various cancers, cardiovascular and neurological conditions, diabetes as well as traits of pharmacogenetic interest, and nondisease end points, such as gene expression and height.

There have been a large number of signals revealed by GWA studies, as shown in Figure 1 (based on investigations conducted until mid 2009). However, the vast majority of studies led to weak associations, with odds ratios in the order of 1.151.3. Another considerable problem is the usual lack of sound information (or information at all) on the functional meaning of the signals. In addition, continuous updated integration of all evidence, from both oldstudies,current GWA investigations and future replication studies, and careful interpretation of the strength of the evidence are crucial to maximize transparency and lead to informative selection of the next steps of research in this field. Most GWA studies yield at least one highly statistically significant association but almost all the associations are weak.With consistent replication across many teams, the statistical support tends to be very strong. So far, almost all results from cancer GWA studies have pointed to novel loci, previously unidentified. Some of the most robust results for cancer had odds ratios in the order of 1.062.23, but mostly 1.2. Overall, it seems that GWA studies can lead to the identification of some interesting signals, that can shed light on disease mechanisms and perhaps on the involvement of unexpected etiologic factors, but most of such studies and signals seem to be disjointed from the search for environmental causes of diseases. The research streams above have been dominated by research groups in the US and the UK, with the role of Italian groups mainly contributing to the study design and data/sample collection. There are however, notable exceptions, such as the EUsponsored, Italianled collaborative study on the genetics of hypertension “Hypergenes” (http://www.hypergenes.eu/). Together with the GWA explosion that seems to benow levellingoff, therehas been another wave of original research on epigenetics.The characteristics of this wave are considerably different. In this case the emphasis is not on technology (like in the GWA field) but rather onenvironmentalexposures,andItaliangroups have had a leading role. Epigenetic inheritance including DNA methylation, histone modifications, and microRNAs provides a mechanism for the stable propagation of geneactivity states from one generation of cells to the next, in which environmental exposures captured by the epigenome can be perpetuated with lasting health effects. Table 1 summarizes some of the Italian studies (with relevant references). Air pollutants such as PM10 (air particulate) and airborne benzene exposure levels have been associated with changes in methylation of genes involved in inflammation and in carcinogenesis. In one study PM10 (air particulate) exposure levels were negativelyassociatedwith methylation in Alu (p = 0.04) and LINE1 repetitive sequences (p = 0.04). iNOS promoter DNA methylation was significantly lower in post exposure blood samples compared withbaseline (p = 0.02).Inaddition airborne benzene was associated with a significant reduction in LINE1 (2.33% for a 10fold increase in airborne benzene levels; p = 0.009) and Alu (1.00%; p = 0.027) methylation. Hypermethylation in p15 (+0.35%; P = 0.018) and hypomethylation in MAGE1 (0.49%; p = 0.049) were associated with increasing airborne benzene levels. In another study, Baccarelli and coworkersshowed,inalargesample,thatmethylation patterns can rapidly follow changes in exposure to traffic particles. LINE1 methylation decreased after recent exposure to higher black carbon (beta = 0.11; p = 0.002) and PM2,5 (beta = 0.13; p < 0.001 for the 7d moving average). No association was found with Alu methylation (p> 0.12).3 In the same study, individuals with low LINE1 methylation were shown to have increased plasmalevels ofVCAM1,an establishedbiomarker of cardiovascular risk, as well as increased incidence and mortality from ischemic heart disease and stroke. In other works, exposures to lead and polycyclic aromatic hydrocarbons were associated with alterations of DNA methylation.4-10 These examples show the importance of exposures in epigenetic studies. All the investigations reported in Table 1 were based on blood DNA samples. Because epigenetic marks are tissue specific, analyses basedonblood DNA willyield information that cannot be assumed to reflect epigenetic states in other tissues. This is one critical difference between genetics and epigenetics studies. In genetic studies, each tissue is assumed to carry genetic information that is nearly or completely identical to all tissues of a given individual.
Therefore, genetic analysis have used blood, or other easilyobtainablecell types,asaconvenientDNA source regardless of the involvement of those cell types in the disease of concern. In epigenetic studies, investigators need to consider that, because epigenetic marks are tissue specific, the blood leukocyte epigenome is only one of the epigenomes that can be potentially involved in a given disease.The role in the disease being investigated of the cell type used as the DNA source needs to be carefully considered in epigenetics. Analysisof multiple tissues might be needed to fully understand the process underlying a disease state.

The integration of genomics and other omics

Finally, it is worth mentioning that newly conducted research tends to integrate several omic technologies. An example of EUfunded study, where Italian groups have a prominent role, is Envirogenomarkers (see http://www.envirogenomarkers.net/). The project concerns the largescale application of omics technologies in a population study aiming at: a) the discovery and validation of novel biomarkers predictive of increased risks of chronic diseases in which the environment may play an important role (breast cancer, Non Hodgkin’s lymphoma, childhood diseases including allergy, neurological and immune diseases, thyroid disruption), b) the exploration of the association of such risk biomarkers with exposure to a number of highpriority or emerging environmental pollutants with carcinogenic, immunotoxic or hormoneline properties, including polychlorinated biphenyls (PBCs), polycyclic aromatichydrocarbons (PAHs), cadmium,lead, phthalates, brominatedflameretardants,ambient air pollutants and water treatment byproducts), c) the discovery and validation of biomarkers of exposure to the above environmental pollutants. Envirogenomarkers (EGM) can be considered as an example of a new generation of studies, largely due to the new highthroughput technologies becoming mature for application in large population cohorts.The EGM project was preceded by a long series of validation studies aiming at assessing the robustness of laboratory technologies for cohort studies. In addition, as opposed to GWA, EGM studies put much emphasis on exposure assessment for environmental exposures.

Bibliografia/References

  1. Vineis P, Bartsch H, Caporaso N et al. Genetically based Nacetyltransferase metabolic polymorphism and lowlevel environmental exposure to carcinogens. Nature. 1994; 369(6476): 154-56.
  2. Hashibe M, Boffetta P, Zaridze D et al. Evidence for an important role of alcoholand aldehydemetabolizing genes in cancers of the upper aerodigestive tract. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006; 15(4): 696-703
  3. Bollati V, Baccarelli A, Hou L et al. Changes in DNA methylation patterns in subjects exposed to lowdose benzene. Cancer Res 2007; 67: 876-80.
  4. Tarantini L, Bonzini M, Apostoli P et al. Effects of particulate matter on Genomic DNA methylation content and iNOS promoter methylation. Environ Health Perspect 2009; 117: 217-22.
  5. Baccarelli A, Wright RO, Bollati V et al. Rapid DNA methylation changes after exposure to traffic particles. Am J Respir Crit Care Med 2009; 179: 572-78.
  6. Bollati V, Schwartz J, Wright R et al. Decline in genomic DNA methylation through aging in a cohort of elderly subjects. Mech Ageing Dev 2009; 130: 234-39.
  7. Baccarelli A, Tarantini L, Wright RO et al. Repetitive element DNA methylation and circulating endothelial and inflammation markers in the VA normative aging study. Epigenetics 2010; 5.
  8. Baccarelli A, Wright RO, Bollati V et al. Ischemic heart disease and stroke in individuals with low blood DNA methylation: prevalence, incidence and mortality in the VA normative aging study. Epidemiology (in press).
  9. Wright RO, Schwartz J, Wright RJ et al. Biomarkers of lead exposure and DNA methylation within retrotransposons. Environ Health Perspect 2010; 118: 790-95.
  10. Pavanello S, Bollati V, Pesatori AC et al. Global and genespecific promoter methylation changes are related to antiB[a]PDEDNA adduct levels and influence micronuclei levels in polycyclic aromatic hydrocarbonexposed individuals. Int J Cancer 2009; 125: 1692-97.
  11. Pavanello S, Pesatori AC, Dioni L et al. Shorter telomere length in peripheral blood lymphocytes of workers exposed to polycyclic aromatic hydrocarbons. Carcinogenesis 2010; 31: 216-21.
  12. Bollati V, Marinelli B, Apostoli P et al. Exposure to metalrich particulate matter modifies the expression of candidate microRNAs in peripheral blood leukocytes. Environ Health Perspect 2010; 118(6): 763-68.
Approfondisci su epiprev.it Vai all'articolo su epiprev.it Versione Google AMP